در پایان فیلم برادران سوپر ماریو، ماریو (کریس پرت) به طور تصادفی بوسر (جک بلک) و همه عواملش را به زمین می آورد. ماریو که از نجات پرنسس هلو (آنیا تیلور جوی) و پادشاهی قارچ از یکی از بمبهای قدرتمند Bonzai Bill توسط Bowser ناامید شده، موشک را به یکی از لولههای سبز جادویی هدایت میکند که همه جهانهای فیلم را به هم متصل میکند. ماریو متوجه نمی شود که با انجام این کار، به طور لحظه ای موانع بین دنیاها را از بین می برد.
آخرین قسمت فیلم برادران سوپر ماریو در همان محله بروکلین اتفاق می افتد که لوئیجی (چارلی دی) و خانواده ماریو در آن زندگی می کنند. ماریو که مصمم است تلاش Bowser را برای ازدواج اجباری با هلو و تسخیر دنیای چندگانه به پایان برساند، در خیابان های خانه خود با Bowser روبرو می شود. متأسفانه، حتی با کمک برخی از دوستان جدیدش - یعنی هلو، وزغ (کیگان-مایکل کی)، و دانکی کونگ (ست روگن) - ماریو نمی تواند کاملاً از Bowser برتری داشته باشد.
همه چیز تغییر می کند، اما زمانی که لوئیجی و ماریو با هم متحد شوند. پس از اینکه اولی برادرش را از نفس آتش کشنده Bowser نجات میدهد، لوئیجی و ماریو سرانجام با جذب قدرت سوپر ستاره محبوب Bowser به وعده عنوان فیلم Super Mario Bros. لوئیجی و ماریو با قدرت آسیبناپذیری و قدرت فوقالعاده ستاره، او را در نبرد تن به تن شکست میدهند. پس از شکست، هلو بوسر را مجبور به مصرف یک قارچ آبی می کند که او را به اندازه کوچک می کند و قادر به آسیب رساندن به دشمنانش نمی کند.
پس از پیروزی بر بوسر، ماریو و لوئیجی برای همیشه به پادشاهی قارچ نقل مکان می کنند. صحنه آخر فیلم The Super Mario Bros.
در طول تیتراژ پایانی فیلم، بینندگان با دو صحنه دیگر روبرو می شوند. اولی با آهنگ مینیاتوری Bowser جک بلک همراه می شود که او تصنیف قدرتمند دیگری را درباره عشق بی حد خود به هلو آنیا تیلور-جوی می خواند. در همین حال، فیلم دوم، تماشاگران را به سیستم تونل زیرزمینی شهر نیویورک می برد تا یک تخم دایناسور خالدار سبز و سفید از پادشاهی قارچ شروع به بیرون آمدن کند.
همانطور که طرفداران قدیمی Super Mario Bros بلافاصله می دانند، صحنه دوم نشان دهنده معرفی یکی از محبوب ترین و شناخته شده ترین شخصیت های نینتندو است. یوشی که عضوی از نژاد دایناسور مانند است، یکی از شناختهشدهترین یاران بازیهای ویدیویی ماریو است. همچنین در اوایل فیلم، ماریو و هلو برای مدت کوتاهی از کنار چندین دایناسور مشابه یوشی عبور می کنند و در جنگل های قارچ پادشاهی قدم می زنند.
اگرچه او قهرمان اصلی این فیلم است، اما ماریو در ماجراجویی هلو، بیتجربه در راه پادشاهی قارچ، به هلو میپیوندد. او ممکن است چابک باشد، همانطور که نشان می دهد چگونه از طریق یک مکان ساخت و ساز در بروکلین می گذرد.
با این حال، ماریو برای اثبات اینکه می تواند شاهزاده خانم را در سفر همراهی کند، به آموزش زیاد و قدرت چند قارچ قرمز نیاز دارد. ماریو ممکن است به تنهایی آنقدر قدرتمند نباشد، اما با منابع مناسب، میتواند در مقابل بازیکنانی مانند Bowser و Donkey Kong در رینگ مقاومت کند.
هلو که پس از پایان یافتن در پادشاهی قارچ توسط وزغها پذیرفته شد، برای محافظت از مردمش و تقویت مهارتهای خود، آموزش دید و به یکی از قویترین رهبران دنیای خود تبدیل شد. او مسیر موانع قلعه را بدون سختی به پایان رساند و ادعا می کند که ابتدا آن را با تلاش بسیار کمی به پایان رسانده است. این ثابت می کند که او می توانست به تنهایی به پادشاهی جنگل برسد.
اگرچه او برای نجات وزغ تسلیم Bowser شد، اما همچنان آماده بود تا با او در نبرد روبرو شود و شجاعت تزلزل ناپذیر خود را در برابر احتمالات زیاد نشان دهد. خوشبختانه، او را در مراسم عروسی خود با یک گل یخ غافلگیر کرد، و او را در یک تکه یخ بزرگ گرفتار کرد و نشان داد که می تواند حتی از قوی ترین دشمنان هم پیشی بگیرد.
Donkey Kong از نظر قدرت بی رحم به وضوح برتر از ماریو و هلو است.به راحتی ماریو را در طول مسابقه گلادیاتور خود در پادشاهی جنگل شکست داد و تنها دلیلی که ماریو کونگ را شکست داد این بود که او با لباس گربهای خود قدرت پیدا کرد.
و هنگامی که او از قدرت گل آتش استفاده می کند، او و ماریو می توانند راه خود را از طریق ارتش بوسر در زمان سوم فیلم طی کنند. نفس ممکن است او را سنگین کند، اما هیچ کس نباید بخواهد با این میمون ماچو دست و پنجه نرم کند.
به عنوان دست راست Bowser، کامک به جادوگری قدرتمندی دسترسی دارد که در برابر دشمنان استادش از آن استفاده می کند. با جادوی خود،به تنهایی بر ارتش پنگوئن پادشاه غلبه می کند و می توانست با تله کینزی خود، وزغ را به خمیر قارچ تبدیل کند. اما کامک حتی با تسلط خود در هنرهای عرفانی، ترس شدیدی را در مواجهه با بوسر نشان داده است و به این معناست که بوسر از او قدرتمندتر است.
پادشاه کوپا شهرت خود را به عنوان ترسناک ترین لاک پشت در دنیای خود به دست آورده است. او با نفس آتشین خود، قلعه یخی پنگوئن کینگ را ویران کرد و پس از اینکه هلو او را در یخ محصور کرد، خود را آزاد کرد. او حتی میتواند در برابر تلاشهای ترکیبی ماریو، هلو و دانکی کونگ در آخرین نبردشان در بروکلین مقاومت کند. و با یک ارتش کامل از Koopas، Goombas، و بسیاری از دشمنان مرگبار دیگر، پادشاهی قارچ و جنگل به سختی می توانند به تنهایی با آنها مقابله کنند.
اما همانطور که بسیاری از بازی ها قبلا ثابت کرده اند، Bowser را می توان شکست داد. ماریو و لوئیجی پس از مهار قدرت سوپر استار به راحتی در نبرد بر Bowser مسلط شدند و او را تا زمانی که دیگر نتوانست بایستد به او کوبیدند. حتی ارتش او هم نمیتوانست برادران سوپر ماریو را در وضعیت شکست ناپذیرشان کند کند. او ممکن است شکست خورده و قفل شده باشد، اما Bowser همچنان بزرگترین تهدید برای پادشاهی قارچ است.